V článku sú uvedené vedecké práce, v ktorých boli larvy Apis mellifera priamo kŕmené potravou obsahujúcou vírus, pričom autori stanovovali dávku vírusu, sledovali jeho množenie alebo hodnotili mortalitu a ďalší vývoj lariev.

Najdôležitejší poznatok: Larvy nie sú voči vírusom rovnako citlivé ako dospelé včely. Pri DWV existujú experimentálne dôkazy, že na vyvolanie produktívnej infekcie orálnou cestou je potrebná pomerne vysoká dávka, ale aj podstatne nižšia dávka môže mať dlhodobé biologické následky.

Nižšie popisujeme práce a štúdie medzi skutočne podanou dávkou, vírusovou replikáciou a mortalitou. To je pri interpretácii výsledkov veľmi dôležité.

1. Najdôležitejšie experimentálne práce

A. Ryabov et al. (2016) – DWV a SBV

The Iflaviruses Sacbrood virus and Deformed wing virus evoke different transcriptional responses in the honeybee which may facilitate their horizontal or vertical transmission.

Autori skúmali infekciu lariev dvoma významnými vírusmi:

• DWV – Deformed Wing Virus.

• SBV – Sacbrood Virus.

Experiment:

• Použili čerstvo vyliahnuté larvy robotníc.

• Larvy chovali na umelej larválnej potrave.

• Po 12 hodinách dostali vírusovú potravu.

• Do 50 μl potravy pridali približne \(10^{10}\) genómových ekvivalentov DWV a \(10^{10}\) genómových ekvivalentov SBV na larvu.

• Vírusovú potravu larvy skonzumovali počas 12 hodín.

• Následne dostávali potravu bez vírusov.

• Analýza prebehla 4 a 9 dní po infekcii.

Výsledky:

Na deviaty deň sa u niektorých lariev zistila veľmi vysoká vírusová nálož:

• DWV: Ct približne 8–14.

• SBV: Ct približne 9–15.

Niektoré larvy mali vysokú nálož oboch vírusov.

Autori použili aj kontrolu s UV-inaktivovaným vírusom, čo je dôležité pri rozlišovaní replikácie od samotnej prítomnosti prijatých vírusových častíc.

Interpretácia: Larvy dokážu po orálnom prijatí DWV a SBV vytvoriť vysokú vírusovú nálož. Použitá dávka však bola veľmi vysoká, takže z tejto práce nemožno určiť minimálnu infekčnú dávku.

B. Ryabov et al. (2020) – Green Bees: Reverse Genetic Analysis of Deformed Wing Virus Transmission, Replication, and Tropism

Táto práca je pre otázku citlivosti lariev mimoriadne významná, pretože autori skúmali rôzne dávky DWV a sledovali, či sa vírus v larvách skutočne replikuje.

Použili geneticky definované varianty DWV a prvostupňové larvy, ktoré dostávali vírus v potrave.

Výsledky po 48 hodinách:

GE znamená genómové ekvivalenty.

Autori zistili, že pri dávke \(5 \times 10^5\) GE bola vírusová RNA detegovateľná, ale neznamenalo to automaticky produktívnu infekciu.

Pri dávkach \(5 \times 10^6\) až \(5 \times 10^7\) GE sa už prejavila výrazná amplifikácia vírusovej RNA nad úroveň prijatej dávky.

Zaujímavé je, že niektoré larvy vykazovali len malú alebo žiadnu amplifikáciu aj po prijatí vírusovej potravy. To poukazuje na existenciu prirodzenej bariéry orálnej infekcie.

Autori dospeli k záveru, že na spoľahlivú infekciu viac ako 50 % lariev bolo potrebných približne \(10^6\) až \(10^7\) genómových ekvivalentov DWV.

Toto je zásadné zistenie: Nie každá larva, ktorá prijme vírus, sa musí stať produktívne infikovanou. Citlivosť závisí aj od variantu vírusu.

C. Zanni et al. (2023) – infekcia DWV už dávkou 1 000 kópií

Age-related response to mite parasitization and viral infection in the honey bee suggests a trade-off between growth and immunity.

Táto práca je mimoriadne zaujímavá, pretože autori použili oveľa nižšiu dávku DWV.

Experiment:

• Larvy vo štvrtom instare (L4).

• 40 mg umelej larválnej potravy.

• Do potravy pridali 1 μl PBS obsahujúceho \(10^3\) kópií DWV.

• Kontrolné larvy dostali rovnakú potravu bez vírusu.

• Larvy pokračovali vo vývoji až do dospelosti.

Výsledok:

Rozdiel bol štatisticky významný (p = 0,01).

Životnosť dospelých včiel, ktoré boli infikované už ako larvy, bola teda výrazne kratšia.

Pri vyliahnutí sa zistil trend vyššej vírusovej nálože, ale rozdiel nedosiahol štatistickú významnosť (p = 0,09).

Dôležitá interpretácia: Dávka 1 000 kópií spôsobila merateľné biologické následky, ale táto štúdia nedokazuje, že 1 000 kópií je minimálna infekčná dávka DWV. Takisto nemožno priamo porovnávať túto dávku s experimentom Ryabova, pretože sa líšil vek lariev, vírusový materiál aj experimentálny protokol.

D. Thaduri et al. (2019) – DWV a ABPV

Disentangling host-parasite-pathogen interactions in a varroa-resistant honeybee population reveals virus tolerance as an independent, naturally adapted survival mechanism. – Scientific Reports (2019)

Autori skúmali orálnu infekciu lariev:

• DWV – vírus deformovaných krídiel.

• ABPV – vírus akútnej paralýzy včiel.

Použité dávky na jednu larvu:

Experimentálny postup:

• Larvy vo veku približne 24–36 hodín boli prenesené do individuálnych odchovných jamiek.

• Po predchádzajúcom odchove dostávali potravu s vírusovou suspenziou.

• Vírusová nálož sa sledovala v časových intervaloch 0, 24, 72 a 120 hodín.

• Autori porovnávali včely z populácií odolných a citlivých na Varroa.

Výsledky:

• DWV vykazoval postupný nárast vírusovej nálože.

• ABPV dosahoval výrazné zvýšenie vírusovej nálože už v prvých 24 hodinách.

• Rozdiely medzi Varroa-odolnými a Varroa-citlivými populáciami neboli v citlivosti na infekciu týmito vírusmi významné.

Podstatné je, že autori najskôr vykonali dávkové optimalizačné experimenty. Zvolená dávka bola najvyššia dávka, ktorá nespôsobovala úhyn pred 96 hodinami po infekcii. Nejde teda o minimálnu infekčnú dávku.

E. Transcriptome-level assessment of the impact of deformed wing virus on honey bee larvae (2021) – PubMed (2021) Autori skúmali larvy Apis mellifera infikované DWV.

Vplyv infekcie na larválny vývoj

Použitá dávka:

kópií DWV na larvu.

Výsledky:

• Počas larválneho štádia nebola zaznamenaná významná mortalita.

• Replikácia vírusu sa začala približne 2 dni po inokulácii.

• Do štvrtého dňa sa vírusová nálož výrazne zvýšila.

• Počas kuklového štádia pokračoval nárast vírusovej nálože.

• Mortalita sa významne zvýšila v kuklovom štádiu.

• Autori identifikovali 255 diferenciálne exprimovaných génov.

Toto je dôležitý výsledok: Larva môže prijať veľmi vysokú vírusovú dávku, prežiť larválne štádium, ale následne uhynúť počas vývoja kukly.

F. Doublet et al. (2015) – BQCV

Early life exposure to sublethal doses of pesticides and pathogens induces long-term susceptibility to infection in honey bees.– Vyhľadať publikáciu Doublet et al. (2015)

Táto práca sa zaoberala aj infekciou BQCV v súvislosti s ďalšími stresormi.

Podľa prehľadovej práce Yañez et al. (2020) boli pri experimentoch použité tieto dávky:

• Larvy pred kuklením: \(1{,}4 \times 10^7\) genómových ekvivalentov BQCV na larvu.

• Dospelé včely: \(1{,}4 \times 10^9\) genómových ekvivalentov na včelu.

Pri dávkových experimentoch bola zvýšená mortalita lariev zaznamenaná najmä pri vysokých vírusových titroch.

G. Chinese Sacbrood Virus (CSBV) – novšia práca z roku 2025

Comparative transcriptome analysis reveals various host responses to sacbrood virus infection in Apis cerana and Apis mellifera.

Táto práca je zaujímavá tým, že skúma SBV infekciu u dvoch druhov včiel vrátane Apis mellifera.

Experiment:

• Použili trojdňové larvy.

• Každá larva dostala 2 μl potravy obsahujúcej SBV.

• Koncentrácia vírusovej suspenzie bola \(0{,}5 \times 10^{11}\) kópií/μl.

• Celková dávka teda predstavovala \(10^{11}\) kópií na larvu.

• Vzorky analyzovali po 24, 48 a 72 hodinách.

Autori skúmali vírusovú infekciu a zmeny v génovej expresii hostiteľa.

Je to ďalší príklad experimentálneho vyvolania infekcie lariev pomocou potravy, tentoraz s veľmi vysokou vírusovou dávkou.

2. Porovnanie dávok vo všetkých hlavných prácach

Nasledujúca tabuľka sumarizuje experimentálne dávky, ktoré sú uvedené v publikáciách. Hodnoty nie sú priamo porovnateľné bez zohľadnenia metodiky a veku lariev.

GE = genómové ekvivalenty.

Pri niektorých prácach ide o absolútny počet kópií RNA, pri iných o odhad genómových ekvivalentov. Preto tieto hodnoty nemožno chápať ako jednu štandardizovanú stupnicu infekčnosti.

3. Čo vieme o skutočnej citlivosti lariev?

Z publikovaných experimentov sa dajú vyvodiť tieto závery:

4. Dôležitá otázka: Aká vírusová záťaž sa skutočne nachádza v prirodzenej potrave lariev?

Toto je teraz najväčšia medzera v súčasnom poznaní.

Experimentálne infekcie často používajú dávky rádovo miliónov až miliárd genómových ekvivalentov. V prirodzenom prostredí však larvy môžu dostávať opakované menšie dávky vírusov v potrave od kŕmičiek.

Zaujímavé sú údaje zo štúdie Zanni et al. (2023), ktorá uvádza, že:

• DWV sa nachádza v komerčnom mede a peli v koncentráciách približne \(10^2\) až \(10^6\) kópií/g.

• DWV bol detegovaný aj v hypofaryngeálnych žľazách a larválnej potrave.

• Presné údaje o vírusovej záťaži materskej kašičky však autori označujú za nedostatočné.

Je preto dôležité rozlišovať medzi koncentráciou vírusu v potrave a celkovou dávkou prijatou larvou.

Napríklad potrava s koncentráciou 1 000 kópií/g môže predstavovať úplne inú expozíciu než potrava s koncentráciou 1 000 kópií/ml.

5. Odporúčanie – ktoré práce si určite prečítať

Ak vás zaujíma predovšetkým vzťah medzi vírusovou náložou v potrave a citlivosťou lariev, vybraté sú tieto štyri:

1. Ryabov et al. (2020) – Green Bees. Najlepšie ukazuje dávkovú závislosť orálnej infekcie DWV a rozdiel medzi detekciou RNA a replikáciou.

2. Zanni et al. (2023) – ukazuje dlhodobé následky larválnej expozície aj pri dávke 1 000 kópií DWV.

3. Thaduri et al. (2019) – porovnáva orálnu infekciu DWV a ABPV a sleduje jej dynamiku.

4. Ryabov et al. (2016) – porovnáva biologické reakcie lariev na DWV a SBV.

6. Čo ešte v literatúre chýba?

Podľa nás by bolo veľmi prínosné uskutočniť experiment, ktorý by skúmal nielen jednorazovú infekciu, ale aj opakovanú nízku expozíciu lariev vírusom prostredníctvom potravy.

Napríklad:

• 1. deň: nízka dávka DWV,

• 2. deň: ďalšia nízka dávka,

• 3. deň: ďalšia nízka dávka,

• následne sledovať vývoj až po vyliahnutie.

Takýto experiment by pomohol zodpovedať otázku, či opakovaný príjem malých množstiev vírusového materiálu môže viesť k produktívnej infekcii, aj keď jednorazová dávka by bola nedostatočná.

Dôležité by bolo porovnať aj:

• jednorazovú a opakovanú expozíciu,

• rôzne vekové štádiá lariev,

• jednotlivé vírusy samostatne aj v kombinácii,

• vírusovú replikáciu a mortalitu,

• množstvo vírusovej RNA v čerstvo vyliahnutých včelách.

Práve toto by podľa nás  pomohlo lepšie pochopiť, akú úlohu má prirodzene kontaminovaná larválna potrava pri šírení vírusových infekcií vo včelstve.