Jednou zo sľubných alternatív proti klieštikovi sú peptidové toxíny z jedov článkonožcov.
Globálna produkcia potravín do značnej miery závisí od opeľovacích služieb včiel medonosných (*Apis mellifera*). Tretina svetovej produkcie potravín vzniká priamo alebo nepriamo vďaka hmyziemu opeľovaniu, pričom ekonomická hodnota týchto služieb dosahuje približne 153 miliárd eur ročne. Včely medonosné sú jedným z najdôležitejších manažovaných opeľovačov a prispievajú k výnosom mnohých výživovo hodnotných plodín, čím podporujú potravinovú bezpečnosť a zdravie ľudí. Bohužiaľ, tieto včely čelia viacerým hrozbám vrátane chemických insekticídov, nedostatku potravy v dôsledku úbytku divokých kvetov, vírusov a parazitov.
Najväčšou hrozbou pre včelárstvo sú v súčasnosti parazitické roztoče *Varroa destructor*. Až 85 % strát kolónií *A. mellifera* je priamo spojených s infestáciou týmto parazitom, ktorý navyše prenáša vírusy včiel spôsobujúce ďalšie straty. Po invázii *V. destructor* do Austrálie v roku 2022 a neúspešných pokusoch o eradikáciu sa problém stal skutočne globálnym.
Súčasné syntetické akaricídy (varroacidy) zahŕňajú formamidín amitraz (agonista oktopamínových receptorov), organofosfát coumaphos (inhibítor acetylcholínesterázy) a pyretroidy flumethrin a fluvalinate (agonisty napäťovo riadených sodíkových kanálov). Niektoré populácie *V. destructor* si však už vyvinuli rezistenciu voči týmto látkam. Okrem toho môžu akaricídy kontaminovať med a vosk, čo spôsobuje ďalšie ekonomické straty včelárom. Preto je naliehavo potrebný vývoj nových, včelám priateľských a environmentálne šetrných spôsobov boja proti *V. destructor*.
Jednou z sľubných alternatív sú peptidové toxíny z jedov článkonožcov. Jedovaté pavúky a škorpióny lovia iné článkonožce vrátane iných arachnidov. Známym príkladom je širokospektrálny insekticídny peptid z jedu pavúka ω-hexatoxin-Hv1a (Hv1a), ktorý má aj akaricídny účinok, no prekvapivo nie je toxický pre včely medonosné ani cicavce. V jedoch viac ako 53 000 druhov pavúkov a 2 800 druhov škorpiónov, z ktorých každý obsahuje stovky až tisíce peptidových toxínov, by sa mohli nachádzať látky selektívne toxické pre *V. destructor*, no bezpečné pre prospešné organizmy a človeka. Keďže roztoče *Varroa* trávia väčšinu času prichytené na včelách, topikálna (povrchová) aplikácia je pravdepodobne účinnejšia než pasce.
Autori v štúdii, preto systematicky otestovali 50 taxonomicky rozmanitých jedov článkonožcov (najmä pavúkov a škorpiónov) na topikálnu aktivitu proti *V. destructor*. Pri dávke 10 μg jedu na roztoča spôsobilo 100 % mortalitu 13 jedov (26 %) už po 2 hodinách, 17 jedov (34 %) po 6 hodinách a 39 jedov (78 %) po 24 hodinách. Tento široký výskyt topikálnej aktivity je prekvapivý, pretože jedovaté článkonožce bežne vnášajú jed priamo do tela obete uhryznutím alebo bodnutím. Surfactant Silwet sa pri počiatočnom screene nepoužíval, takže aktivita pochádzala zo samotných jedov. Mechanizmus prieniku peptidov cez kutikulu roztoča (napr. cez mäkkšie časti alebo spirákuly) zostáva nejasný.
Na ďalšiu izoláciu boli vybrané dva jedy s vysokou aktivitou a dostupným množstvom: jed tasmaníjskeho jaskynného pavúka *Hickmania troglodytes* (čeľaď Gradungulidae, dlhoveké cribellátne araneomorfné pavúky endemické pre Tasmániu) a jed obrovského japonského lievikového pavúka *Gigathele gigas* (čeľaď Macrothelidae, primitívny mygalomorfný pavúk).
Frakcionácia jedu *H. troglodytes* pomocou C18 RP-HPLC odhalila stredne komplexný profil. Screening frakcií identifikoval jeden aktívny pík. Ďalšia dekonvolúcia viedla k izolácii dominantného peptidu s monoisotopickou molekulovou hmotnosťou 5639,28 Da. Čiastočná 15-residuová sekvenčná značka získaná MALDI-ISD-MS umožnila vyhľadanie v transkriptóme jedových žliaz *H. troglodytes* (ENA PRJEB15860). Identifikovaný bol kompletný prepropeptid, z ktorého zrelá doména toxínu (KYCAPRKAVCNTPADCCDKSSRCAYPNYGLGYYLDSEFFGKRKICSWRL) má predikovanú oxidovanú hmotnosť 5639,628 Da, čo dobre zodpovedá natívnemu peptidu. Peptid bol pomenovaný μ-gradutoxin-Ht1a (μ-GDTX-Ht1a, ďalej Ht1a) podľa racionálnej nomenklatúry pre peptidové toxíny.
Podobne frakcionácia jedu *G. gigas* odhalila jeden aktívny pík s monoisotopickou hmotnosťou 3286,439 Da. N-terminálna Edmanova sekvenácia poskytla 34-residuovú sekvenciu ILCAPQGGPCVLGILCCAGYKCSPGLLGLVGSCQ. Predikovaná oxidovaná hmotnosť 3286,587 Da sa takmer zhodovala s natívnym peptidom (rozdiel len 0,148 Da), preto sa sekvencia považuje za kompletnú. Peptid bol pomenovaný U₁-macrothelitoxin-Gg1a (U₁-MATX-Gg1a, ďalej Gg1a). Oba peptidy majú neamidovaný C-terminus.
Keďže množstvo natívnych peptidov bolo obmedzené, boli syntetizované miligramové množstvá sHt1a a sGg1a metódou pevno-fázovej syntézy (SPPS). Topikálna aplikácia 0,48 μg peptidu na roztoča (rozpustené v 0,5 % Silwet L-77) významne znížila prežívanie *V. destructor* v porovnaní s negatívnou kontrolou (0,5 % Silwet). Nástup mortality bol však pomalší než pri pozitívnej kontrole (3 % kyselina oxálová, komerčne používaný varroacid): významná mortalita sa prejavila po 16 hodinách pri sGg1a a po 34 hodinách pri sHt1a, zatiaľ čo oxálová kyselina pôsobila už po 2 hodinách.
Povrch tela včely je odhadom približne 34-krát väčší než povrch roztoča. S bezpečnostnou rezervou bola aplikovaná 52-násobne vyššia dávka (25 μg peptidu na včelu). Pri tejto dávke ani sHt1a ani sGg1a nezvýšili mortalitu robotníc *A. mellifera* v porovnaní s kontrolou (2 % Silwet). Topikálna aplikácia teda spôsobovala mortalitu roztočov, no bola bezpečná pre včely pri dávkach ekvivalentných vzhľadom na povrch tela.
Keďže mnohé pavúčie jedové peptidy cielia na napäťovo riadené sodíkové kanály (Naᵥ), autori testovali aktivitu sHt1a na kanáloch *V. destructor* (VdNaᵥ) a *A. mellifera* (AmNaᵥ) exprimovaných v oocytoch *Xenopus laevis*. Oba kanály produkovali robustné Na⁺ prúdy. Inkubácia s 500 nM sHt1a významne znížila peakový prúd AmNaᵥ o 24,7 ± 7,2 % a VdNaᵥ o 25,3 ± 7,8 %, bez významnej zmeny parametrov polovičnej aktivácie alebo inaktivácie. Rovnaká aktivita na kanáloch oboch druhov v kombinácii s absenciou toxicity pre včely pri topikálnej aplikácii naznačuje, že Ht1a buď lepšie preniká cez vonkajšiu bariéru roztočov, alebo včely majú iný mechanizmus rezistencie (napr. enzymatickú inaktiváciu). Tým sa vytvára bezpečnostné okno pre potenciálne ošetrenie. Potencia Ht1a je nižšia než u niektorých silných insekticídnych pavúčích toxínov (napr. Tx4(6-1) s IC₅₀ 25 nM), čo naznačuje, že Naᵥ kanály nemusia byť primárnym cieľom Ht1a.
Ďalej boli testované off-target aktivity na ľudských iónových kanáloch a receptoroch. Ht1a a Gg1a boli neaktívne na ľudských kostrovosvalových (hNaᵥ1.4), srdcových (Naᵥ1.5) a neuronálnych izoformách Naᵥ kanálov, ako aj na ľudskom napäťovo riadenom vápnikovom kanáli Caᵥ2.2. Na ľudských α3β2/4 nikotínových acetylcholínových receptoroch bol Gg1a neaktívny, zatiaľ čo 10 µM Ht1a čiastočne blokoval nikotínom mediovaný príliv Ca²⁺.
Záver a širší význam
Systematický skríning 50 jedov článkonožcov ukázal, že varroacídna aktivita je medzi jedmi pavúkovcov prekvapivo bežná. Frakcionácia dvoch najúčinnejších jedov viedla k identifikácii peptidov Ht1a a Gg1a, ktoré sú pri topickej aplikácii letálne pre roztoča Varroa, no bezpečné pre včely. Slabá alebo žiadna aktivita voči kľúčovým ľudským iónovým kanálom a receptorom naznačuje, že tieto peptidy sú pravdepodobne selektívne pre bezstavovce.
Autori zdôrazňujú, že hoci ešte zostáva potrebné preskúmať prípadné rezíduá v úľových produktoch a vykonať podrobnejšie toxikologické testy zamerané na človeka, ich výsledky naznačujú, že postrekovanie úľa peptidmi Ht1a a Gg1a by mohlo predstavovať účinnú stratégiu boja proti Varroa, ktorá by bola bezpečná pre včelárov aj pre samotné včelstvá.
Prekvapivá je aj samotná skutočnosť, že jedy pavúkov, ktoré sú evolučne prispôsobené na vstrekovanie priamo do tela obete, majú tak širokú topickú účinnosť. To otvára zaujímavú otázku o ekologickej úlohe týchto akaricídnych toxínov. Vzhľadom na to, že roztoče radu Mesostigmata (kam patrí aj samotná Varroa) bežne parazitujú na pavúkoch, sa javí ako pravdepodobné, že takéto topicky pôsobiace toxíny mohli u pavúkov evolučne vzniknúť práve ako obrana proti parazitom. Zároveň by mechanizmus prieniku týchto peptidov cez povrch tela roztoča mohol byť zaujímavým podnetom na prehodnotenie niektorých nedávnych definícií samotného pojmu „jed“.